Autora: Sadaf Aslam, investigadora colaboradora de la Universidad de Burgos.

En 1962, se aisló la proteína verde fluorescente (GFP) de la medusa Aequorea victoria (1, 2) como subproducto de la purificación de aequorina. En aquel momento se incluyó una nota a pie de página en la que se afirmaba que «también se ha aislado del extracto filtrado una proteína que da soluciones de aspecto ligeramente verdoso a la luz del sol, amarillento bajo luces de tungsteno, y que exhibe una fluorescencia verdosa muy brillante en el ultravioleta de un mineralito». Poco sabían entonces que se trataba de una caja de Pandora a punto de abrirse. Casi 30 años después del aislamiento de la GFP, se clonó su genoma en 1992 (3) y la investigación demostró que no necesitaba ninguna proteína adicional de A. victoria para ser funcionalmente activa. Con el tiempo, se hicieron versiones modificadas genéticamente de la GFP más brillantes y estables y otras variantes que iluminaban colores distintos como el azul, el cian y el amarillo (4). Estos novedosos descubrimientos permitieron a los científicos estudiar diferentes proteínas y mecanismos in vitro (tubo de ensayo) e in vivo (animales). En 2008, los doctores Shimomura, Chalfie y Tsien, los tres pioneros que descubrieron y desarrollaron esta proteína, fueron galardonados con el premio Nobel de Química.

Usos de la fluorescencia verde en las proteínas

Las proteínas fluorescentes pueden pegarse a proteínas de interés y visualizarse al microscopio tanto en vivo como tras haber sido fijadas químicamente. Se puede ver la dinámica espacial y temporal de una proteína, su localización en una etapa y un momento determinados. También se han utilizado como reporteros para rastrear la expresión de determinadas proteínas durante diversos acontecimientos en vivo, por ejemplo, cuando están codificadas por virus, pueden utilizarse para rastrear la progresión de la infección en ratones o en células a lo largo del tiempo. Las proteínas fluorescentes que expresan diferentes colores pueden utilizarse para rastrear diferentes proteínas simultáneamente. Hasta el descubrimiento de estas proteínas, las interacciones proteína-proteína se estudiaban de forma más bioquímica, con ensayos basados en la inmunodetección por anticuerpos, como las co-inmunoprecipitaciones y los ensayos ‘pull-down‘, que aún se utilizan y son relevantes, porque dan cierto tipo de información (confirmación de la interacción) mientras que con las proteínas fluorescentes podemos obtener una lectura más visual.

Desde el aislamiento inicial de estas proteínas hasta ahora, se han desarrollado distintos tipos de ensayos y herramientas para emplearlas  con la microscopía de fluorescencia. Nosotros hemos utilizado uno de estos sistemas para explorar en mayor profundidad la ruta de señalización celular que más nos interesa. El ensayo de complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) se desarrolló en 2001-2002 (5, 6 tomándola proteína amarilla fluorescente (YFP) y dividiéndola en dos partes que no son fluorescentes por sí mismas, y fusionando una de las dos partes a una proteína de interés (“A”)  y  la otra mitad a otra proteína “B”. Si la proteína A y la B interactúan, las dos mitades de la YFP se unirán, reconstituyendo el fluoróforo original, y darán una fluorescencia amarilla bajo el microscopio de fluorescencia. Sin embargo, si las dos proteínas no interactúan, no reconstituirán la YFP y no habrá señal fluorescente.

Figura 1. Diagrama esquemático que muestra cómo funciona el ensayo de complementación de fluorescencia bimolecular a nivel estructural y molecular.

Desde que se desarrolló este sistema, se ha utilizado para estudiar diversas interacciones proteína-proteína y ha dado lugar a nuevos descubrimientos. En uno de estos estudios lo empleamos para visualizar la localización de sensores tempranos del sistema inmunitario presentes en el interior de las células (receptores de reconocimiento de patógenos [PRR]) (7). Así, por ejemplo, pudimos ccomprobar la interacción de RIG-I y MAVS, miembros de esta familia de sensores tempranos, con una proteína del virus de la gripe (NS1). Como se muestra en la figura 2, la BiFC se configura entre RIG-I y NS1 y MAVS y NS1 y muestra claramente que NS1 interactúa con RIG-I (YFP presente) pero no con MAVS (sin YFP). Este sistema puede utilizarse para visualizar muchas otras interacciones y estudiar diferentes rutas de señalización.

Figura 2. Células transfectadas con diferentes complejos BiFC y teñidas para NS1. La fila I muestra BiFC con RIG-I y NS1 y la fila II muestra BiFC con MAVS y NS1. NS1 interactúa con RIG-I pero no con MAVS. (Adaptado de Sanchez-Aparicio et al, 2017).

Estudiando la respuesta a la gripe

En mi tesis, he utilizado este sistema para estudiar la diversidad de la vía de la fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) de clase IA y su interacción con la proteína no estructural 1 (NS1) del virus de la gripe A. La PI3K de clase IA consta de subunidades reguladoras y catalíticas que se unen y mantienen la vía en un estado inactivo hasta que llega un estímulo y provoca un cambio de conformación que activa la señalización. Existen dos formas de la subunidad reguladora y tres formas de las subunidades catalíticas, lo que puede dar lugar hasta seis combinaciones únicas (8). Ya se ha demostrado que la proteína NS1 de la gripe se une a la subunidad reguladora y de esa forma activar la ruta (9). Estas interacciones se descubrieron a través de vías bioquímicas, como se muestra en la figura 2, donde por co-inmunoprecipitación se aprecia que NS1 se une exclusivamente a uno de los isotipos de la subunidad reguladora (β) pero no al otro (α). Para validarlo, se aislaron estructuras cristalinas que también mostraban perfectamente la interacción entre la subunidad reguladora p85β y NS1 (10).

Figura 3. Ensayo de ‘pull down’ que muestra la unión de NS1 sólo con la subunidad reguladora. Adaptado de Hale et al, 2006.

Sin embargo, todos estos ensayos no nos permiten visualizar la unión de la subunidad reguladora y catalítica ni su localización a nivel celular. Así que aprovechamos el sistema BiFC y establecimos un ensayo fusionando las dos mitades de la YFP a las distintas subunidades reguladoras (p85) y catalíticas (p110) de PI3K. Pudimos confirmar visualmente que estas dos proteínas interactúan. Ahora, utilizaré este sistema para seguir estudiando el papel de NS1 en su capacidad de interactuar con las distintas combinaciones de PI3K y comprender mejor el papel de las distintas isoformas en la respuesta frente al virus de la gripe.

Referencias

  1. Shimomura O, Johnson FH, Saiga Y.1962. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol 59:223-39.
  2. Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC.1994. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263:802-5.
  3. Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW, Prendergast FG, Cormier MJ.1992. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene 111:229-33.
  4. Tsien RY.1998. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem 67:509-44.
  5. Nagai T, Sawano A, Park ES, Miyawaki A.2001. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proc Natl Acad Sci U S A 98:3197-202.
  6. Hu CD, Chinenov Y, Kerppola TK.2002. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell 9:789-98.
  7. Sanchez-Aparicio MT, Ayllon J, Leo-Macias A, Wolff T, Garcia-Sastre A.2017. Subcellular Localizations of RIG-I, TRIM25, and MAVS Complexes. J Virol 91.
  8. Ayllon J, Garcia-Sastre A.2015. The NS1 protein: a multitasking virulence factor. Curr Top Microbiol Immunol 386:73-107.
  9. Hale BG, Jackson D, Chen YH, Lamb RA, Randall RE.2006. Influenza A virus NS1 protein binds p85beta and activates phosphatidylinositol-3-kinase signaling. Proc Natl Acad Sci U S A 103:14194-9.
  10. Hale BG, Kerry PS, Jackson D, Precious BL, Gray A, Killip MJ, Randall RE, Russell RJ.2010. Structural insights into phosphoinositide 3-kinase activation by the influenza A virus NS1 protein. Proc Natl Acad Sci U S A 107:1954-9.

Artículo original en inglés. Traducción de UCC+i-UBU, revisada por la autora.

Este artículo ha participado en el VII Concurso de Artículos de Divulgación Científica de la Universidad de Burgos.